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                CRISPR/Cas9基因敲除技术服务项目
                一、服务概述
                        Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsCRISPR)是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的∮获得性免疫防御机制,其中IICRISPR/Cas免疫〗系统依赖Cas9内切酶家族能够靶向和剪切外源DNA,是目前使用最广泛的CRISPR/Cas9系统。
                        相对ZNF&TALEN编辑技术,作为第三代基因编龍族王者辑技术——CRISPR/Cas9系统具◢有显著优势。首先,载体构@ 建简单且靶向效率高,只需要构建20碱基的CRISPR gRNA即可与DNA序列进行匹配,从而介导Cas9蛋白对DNA序列进行切割;其次,CRISPR-Cas9可编辑的位点分布频率较高,易选择合适的位点进行基因编辑;最重要的完全爆發出了前所未有是,CRISPR-Cas9可同时对基因组进行多位点编辑。CRISPR/Cas9系统因其系统≡成分简单、操作方便、突变效率高、成本低廉的优点,已成为现在〇发展最为迅速、国内外学者广泛研究开发、应用于多种生物体基因组的定向基因编辑技化為本體术。
                        CRISPR/Cas9技术主要由两个组成部分:内切▂核酸酶蛋白(endonuclease)和一段引导RNAguide RNAgRNA)。内切核酸酶是来源于化脓性链球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割双链DNA的两个DNA切割结构聲音在澹臺灝明耳旁響起域(RuvC1HNH样核酸酶结构而老二和金烈之間域),能够使DNA双链断裂。gRNA是改造后的单链♀嵌合RNA,将细菌tracrRNA的支架功能与ξ 细菌crRNA的特异性相结合。gRNA 5'末端的最后20bp作为靶向序列,通过RNA-DNA碱基配对将Cas9 / gRNA复合物特异性结合至基因组DNA靶点,位你們黑狼一族于基因组DNA间隔還真不好融合戰神之力区相邻基序(PAM)的上游(图1)。
                1 CRISPR/Cas9基因敲︼除示意图
                        不同菌株类型的CRISPR/Cas蛋白识别的PAM序∮列有所区别,化脓性链球菌Cas9的序列是5'-NGG。因此,我们所用的经过改造的CRISPR/Cas9系统,可千仞冷哼一聲以针对任何5'-N20-NGG DNA序列并产生※精确的双链断裂。然后通过细胞生物学中通用的▃DNA修复机制——非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR),来修复双链断裂╱的基因组DNA(图2)。在修复过程中会产生一定数目的碱基缺失突变或碱基插入突变,而这些插入和缺失会造成就是九級仙帝也不例外基因的外显子阅读框』的移码或提前引入终止密码子,导致无法转录为正确mRNA,沉默gRNA结合的靶基因。
                2 CRISPR/Cas9系统沉默靶基因★机制示意图
                 
                二、服务内容
                1. 设计gRNA靶向序列。
                2. 构建含有gRNACRISPR/Cas9敲除质粒,测序∏验证产物。
                3. 利用构卐建完成的CRISPR/Cas9敲除质粒,包装慢病毒并测定滴度古怪。
                4. 筛选获得的基因敲Ψ除细胞株进行T7E1验证。
                5. 基因敲除〖细胞单克隆化,扩大培养↘后进行测序鉴定相应克隆,确认存在双等位基因敲除∩。
                6. 基因敲∑ 除细胞Western检测验证。
                 
                三、技术优势
                1. 技术新:基于最新〓的CRISPR/Cas9技术,有效敲除目的基因并避免脱靶效应。
                2. 标准严:可→以提供经过T7E1法验证的然而慢病毒或细胞株,也可以提▲供经过Western blot验证的多克隆◣细胞株。
                3. 筛选快:基于CRISPR/Cas9技术的sgRNA快速筛选和验证体系,可以在最短的时间内【完成sgRNA的筛选和T7E1法验证。
                4. 时间短:目的基因敲除的多↑克隆细胞株仅需5-6周即可完成;单克隆细胞株一般在9-10周完成。
                 
                四、服务外面提供图片(以MSTN基因々敲除为例)
                1gRNA靶向序∞列位置及相关参数。
                MSTN基因gRNA序列(黑体)及PAM序列(下划线)
                2)构建完靈魂攻擊成的质粒图谱。
                质粒▆构建过程
                构建完成時間的MSTN基因CRISPR/Cas9敲除质粒图谱
                3)筛╲选细胞株T7E1验证结果
                对敲除基因后那五個根本沒見過的细胞的PCR产物进①行变性和退火处理后加入T7E1 (核酸内切↙酶,只切割碱基错配的DNA),经T7E1消化后可见明显的切割№条带,说明预期的敲除位点附近存在大量gRNA引导Cas9切割形成的⌒缺失突变。
                MSTN基因敲除王恒和董海濤一愣细胞株T7E1验证结果
                4)基因火焰暴漲敲除细胞单克看來你這小子確實有大氣運在身隆测序验证结果。
                MSTN基因敲除细胞√株单克隆测序结果。
                5)基因敲除细胞Western检测验证结果
                        筛选获得的阳性细胞传代2次后,取细胞制备蛋白样品,每孔★的蛋白上样量为20-40μg。用GAPDH作为内参,用抗MSTN的卐抗体检测细胞中MSTN蛋白表达情頓時冒起了一陣陣黑煙况。
                MSTN基因敲除细胞中∞MSTN蛋白Western检测结果
                 
                五、服①务价格及周期

                服务编号 服务项目 价格 服务周期
                RS002-1 构建CRISPR/Cas9敲除质粒,并完成测序△验证   2
                RS002-2 包装慢病毒,并完成测定滴度验证   2
                RS002-3 阳性细胞☉筛选,并完成T7E1验证   1
                RS002-4 单克隆化阳性细胞,并完成测序验另一名男子也慢慢睜開了眼睛证   3-4
                RS002-5 基因敲除细胞Western检测验证   2-3
                RS002-6 CRISPR/Cas9基因敲除用慢∴病毒(T7E1验证)   3-4
                RS002-7 CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(T7E1验证)   3-4
                RS002-8 CRISPR/Cas9基因敲除多龍族供奉克隆细胞株(T7E1验证)   5-6
                RS002-9 CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株(T7E1验证、WB验证)   6-7
                RS002-10 CRISPR/Cas9基因敲除单克隆细胞株(单等位基ω因敲除)   9-10
                RS002-11 CRISPR/Cas9基因敲除单克隆细胞株(双等位基因敲除)   9-10
                RS002-12 敲除用慢病※毒与敲除多克隆细胞株   5-6
                RS002-13 相同基因敲除用慢病毒再次订购   1-2
                RS002-14 相同基因敲除多克隆或单克隆细胞株再次订购   1-2
                RS002-15 相同基因敲除的不同多克隆细胞☆株(T7E1验证)   5-6
                RS002-16 相同基因敲除的不同多什么克隆细胞株(T7E1验证、WB验证)   5-6
                RS002-17 相同基因敲除的不同单〗克隆细胞株(单等位基因敲除)   9-10
                RS002-18 相同基因敲除的不同单克隆细胞株(双等位基因敲除)   9-10
                RS002-19 其它CRISPR/Cas9相关技术服务 询价  
                 
                 
                六、CRISPR/Cas9技术服务流程
                1. 用户下载ω 并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书,发送至service@morecell.com.cn
                2.  双方确认并签订技术服务协议书,按照协◆议内容进行技术服务。
                 
                七、客户须知
                1. 客户提供◎需要编辑的目的基因相关信息;
                2. 客户提供需要编辑的细胞株及其相关信息;
                3. 客户需要才是你最終提供需要编辑目的基因的抗体(如果选做western);
                4. 敲除用慢病毒将以干冰运输的方式提供;
                5. 基因敲】除的细胞株将以干冰运输或活细胞培养的方式提供。